2 活性測定

在試管中進行的酵素活性分析，與在生物体內的酵素反應，有相當的差距；為使反應達最大活性 (Vmax)，或往指定方向進行，所使用基質濃度為十倍Km。

反應的最適pH、溫度、 ... 目 錄 酵素純化方法 酵素分析方法 問 題集 Home 1 蛋白質定量法 2 酵素活性測定法 3 電泳檢定法 4 分子量決定法 5, 6,7 其他工具  　 2.1  催化反應2.2  酵素活性分析   2.2.1 酵素活性測定方法   2.2.2 中止酵素反應方法   2.2.3  連續測定法   2.2.4  澱粉磷解脢活性分析2.3  維持酵素活性   2.3.1 緩衝液   2.3.2 試劑的保存   2.3.3 酵素活性之維持   2.3.4 酵素活性單位　 　 5 蛋白質構造分析6 免疫學工具7 蛋白質科技   2 酵素活性測定法︰  2.1  催化反應： TOP ▲  a. 反應設計原則 大部分酵素反應方式，都可包括在圖 2.1 的大綱中；建立酵素活性測定步驟時，請注意以下原則︰ (1) 測定生成物的產生量，比測基質(反應物)的消失量，更方便且靈敏；儘量避免測定生成物。

(2) 反應流程儘量簡單，太複雜的操作過程，增加工作量及成本，且容易造成失誤。

(3) 複雜的反應，可能產生某些意外的生成物(或pH改變)，回饋抑制 酵素反應 (以負號表示)。

(4) 反應條件要有利於指定反應方向 的進行，可以移除生成物 (以籃框表示)，或接上耦合反應。

(5)小心樣本中有無其他酵素(或抑制劑) 干擾，會因為消耗反應物或生成物，而加強或減弱目標酵素的活性，造成假象。

　 圖 2.1 酵素活性分析及偵測原則 b. 反應基質及酵素濃度 在試管中進行的酵素活性分析，與在生物体內的酵素反應，有相當的差距；為使反應達最大活性 (Vmax)，或往指定方向進行，所使用基質濃度為十倍 Km。

反應的最適 pH、溫度、時間等條件，均需以實驗求得；尤其酵素的用量影響結果甚鉅，要事先找出最適當的使用濃度。

　 TOP ▲ 　  2.2  酵素活性分析： TOP ▲  酵素活性的偵測，通常是固定在一段 時間 (t)內，觀察 生成物 的產量 (P)。

因此反應進行一定時間後需中止反應，再進行生成物的定量。

而 P/t即為此酵素的 反應速率 (vo)，也就是酵素活性。

但若可連續記錄反應過程，則有無中止反應並不重要。

2.2.1 酵素活性測定方法 反應一段時間 (t)後中止反應，測生成物量 (P)即得活性 (P/t)。

以下為各種測定生成物的方法，任何物理、化學甚或生物方法都可使用。

a. 直接測定生成物 所有去氫脢均可測定 NAD+與 NADH 間的變化量，即為去氫脢的活性；例如酒精去氫脢 催化下式之正反向反應：         Ethanol＋ NAD+→ Acetaldehyde＋ NADH＋ H+   反應液中 NADH在 340nm波長有吸光變化 (如圖 2.2)。

■ 酵素活性的測定 圖 2.2 NADH吸光光譜 b. 耦合反應法 若生成物 (P) 無法直接測得，設法把生成物再進行耦合反應，變成可測量的產物 (Q)；很多酵素可耦合到上述去氫脢的反應，則可測 340nm波長變化。

                              S →P→Q ■ Hexokinase的耦合反應 c. 化學測定法 若生成物具有 化學活性，則可直接進行化學反應； 例如蔗糖以 轉化脢 (invertase,IT) 水解成果糖及葡萄糖，可測定生成物還原糖的還原力。

　 d. 放射線測定法 若基質分子中含放射性核種，酵素反應後追蹤生成物的放射線量，即可知酵素活性。

麻煩的是，要分離開反應物及生成物，有時不太容易；可用 HPLC、濾紙色析法 (PPC) 或離子交換法等。

     ■ PCsynthase的例子 e. 測壓法 (manometry) 若生成物為氣体，則可測定氣体体積之增加量；尤其有氧氣生成時，可用 Warburg氏呼吸計測之。

　 f. 電極 有些電極可直接測定反應的變化；例如若有 pH或氧濃度的改變，則可用pH計或氧電極。

酵素電極把酵素固定在薄膜上進行反應，然後直接測定反應物的改變，相當方便；但多用在工業或醫療界有大量樣本待檢測者。

　 g. HPLC 檢定法 若產物無法以其他任何方便的方法檢測時，最終可用 HPLC來分析產物，但相當費時。

　 TOP ▲ 　 2.2.2 中止酵素反應的方法  注意任何中止反應的方法均不得破壞生成物，或干擾儀器測定。

　 a. 用3-5%TCA(三氯乙酸)改變pH，使酵素變性沉澱，再離心去除沉澱取上清。

b. 急速加熱(100℃水浴)10min，注意有些蛋白質(如RNase)仍然無恙。

c. 用1%SDS中止反應，注意proteaseK 等在SDS下仍有活性。

d. 若該酵素需二價離子，則加入EDTA 中止反應。

e. 若該酵素有專一性抑制劑，則可加入抑制劑。

f. 若使用放射性基質，可加入大量不具放射性 (cold)的基質，看來放射性的生成物不再產生，但酵素反應實際上並沒有停止。

　 ■ SDS如何作用 　 ■ Pulse-chase的例子 TOP ▲ 　 2.2.3 連續測定法 連續測定法可不用刻意中止酵素反應，但通常要使用儀器同步監控生成物。

 　 a. 連續測定法 若酵素反應，在其催化過程中可以一邊進行觀察，則可連續測定反應的情形，不須中止反應，上述 酒精去氫脢即可連續監視340nm 波長的變化。

若生成物無法直接觀測，則可接續一耦合反應，把生成物轉變為容易觀察的物質。

　 b. 連續的耦合反應 耦合反應在連續測定法應用相當多，但由於耦合反應更複雜，甚至成為一個迷你的代謝途徑；這種複雜的反應中有較多試劑與產物，許多不必要的副反應可能出現，干擾反應結果；要作好對照的 控制組，以免有假結果出現。

　 TOP ▲ 　 2.2.4 澱粉磷解脢活性分析 以 澱粉磷解脢 為範例，說明如何以生物化學方法偵測到其活性。

a. 澱粉磷解反應 注意磷解不是水解，此反應為可逆 (Pi為無機磷)：    (Glc)n-Glc+      Pi       → (Glc)n         +  Glc-1-P  (磷解方向)    (Glc)n        +  Glc-1-P → (Glc)n-Glc +       Pi      (合成方向) 合成方向反應可測 無機磷 (Pi)生成，而 Pi的檢定有方便的化學呈色反應。

反之，磷解方向應如何設計方便的活性分析方法？ 　 圖 2.3 澱粉磷解脢的活性分析及干擾因子 b. 澱粉鏈延長 澱粉磷解脢以可溶性澱粉作為 引子 (primer)，催化 Glc-1-P 連接到引子上，成為較長的直鏈澱粉 (amylose)，可用 碘液呈色觀察。

在原態電泳膠片，澱粉磷解脢活性可用此法染色，直接在膠片上看到酵素活性 (如圖 2.3A)。

◇ 引子是一小段澱粉分子 c. 小心其它干擾物質 澱粉磷解脢的兩種基質很容易受到其它酵素的作用： 可溶性澱粉受到 b-amylase (BA)澱粉脢快速水解，澱粉磷解脢活性被抑制；Glc-1-P 受phosphatase (Ph)磷酸脢的水解，產生游離的磷酸，會誤判為澱粉磷解脢的活性 (圖 2.3B)。

　 TOP ▲ 　  2.3  維持酵素活性： TOP ▲  酵素是有活性的分子，而可能隨時失去活性；應該考慮各種最佳的環境與條件，以便使酵素保持在最安定的狀態。

酵素的緩衝液是最關鍵的因素。

2.3.1 緩衝液 緩衝液可維持溶液的恆定酸鹼度及離子濃度，兩者都會影響酵素的活性。

  ■ 弱酸如何成為緩衝分子？    ■ 如何導出H-H公式 a. 緩衝液有其使用範圍 各種緩衝液都有其適用的 pH範圍，表 2.1 列出常用的緩衝液。

Serva 表 2.1各種常用緩衝液及其使用範圍 b. 添加物都有作用 經常在緩衝液中加入一些物質，以增加酵素安定或保持活性 (表 2.2)。

　 表 2.2 緩衝液各種添加物質的作用及其使用濃度 c. 溫度的影響 緩衝液用來維持溶液恆定的 pH，但需注意有些緩衝液的 pH受溫度影響很大 (如 Tris)；故製備緩衝液時，要考慮此緩衝液將要在什麼溫度下使用。

■ 緩衝液使用注意事項 d. 濃度的影響 改變緩衝液的濃度，對其 pH可能有影響。

緩衝液的種類不同，酵素活性的表現也會有差異，有些酵素甚至失去活性。

圖 2.4列出各種不同實驗情況下，緩衝液的使用濃度範圍。

   圖 2.4 緩衝液使用濃度的大概範圍 e. Stocksolution 緩衝液可以十倍濃度貯存，高濃度可防止微生物生長，並保持每次實驗所使用藥品的穩定度。

注意在稀釋後，溶液的pH 也許會改變一些，尤其是磷酸緩衝液很容易受到濃度改變所影響。

　 TOP ▲ 　 2.3.2 試劑的保存 試劑的適當保存非常重要，要依照廠商所指示的溫度貯存。

a. 避免潮解 注意每當試劑由冷藏庫取出時，要等它回到室溫後才能打開，否則水氣會附在藥品的表面，進而潮解或破壞之。

　 b. 分裝凍藏 常用的冷藏藥品以 小量分裝(aliquot) 後凍藏，是最好的貯藏方式，尤其是溶液狀態的生物活性試劑 (如酵素)，切勿反復 凍結-解凍。

  ◆ 有些酵素經不起凍藏，一旦結冰後再解凍，活性快速下降。

例如本實驗課所純化的澱粉磷解脢請勿凍藏，放在 4℃即可。

　 c. 甘油凍藏 於低溫 (-20℃) 貯藏的酵素溶液，若保存在 50%甘油 就不會凍結，隨時取用；但須注意所含的甘油，對下一步反應有無影響。

　 d. 避光防菌 很多試劑要 避光 貯存，或須放在乾燥器中，避免長霉長菌。

　 TOP ▲ 　 2.3.3 酵素活性之維持   a. 酵素的安定性不同 酵素在細胞中合成後，有的分泌到細胞外，有的運送到細胞器官中貯存或應用。

前者 (分泌性酵素) 因為要在細胞外的惡劣環境中生存，因此較為堅韌，不易受到破壞； 反之，細胞內的酵素，都以較濃的濃度集中在保護良好的胞器內或胞膜上，一但抽離細胞暴露在氧氣中，可能很容易失去活性。

■ 細胞內外酵素分佈 b. 酵素失活的原因 可歸類成如下的物理性或化學性原因。

(1) 蛋白質 變性： 離開細胞的生理環境後，蛋白質可能遇到極端的 pH 條件、不適的溫度或變性劑(如 SDS 或尿素)，均會使蛋白質的構形破壞。

(2) 酵素 活性區破壞： 在抽取過程中，若失去 cofactor，或者活性區的關鍵胺基酸被修飾，均可造成。

最常見的影響是氧化，尤其是 cysteine 上的-SH 基很容易被氧化。

一般加入 EDTA除去可活化氧分子的二價離子；或加入抗氧化劑，以自身氧化防止 -SH基氧化。

(3) 蛋白脢水解： 細胞內有許多蛋白脢，細胞被打破後即釋放到酵素溶液中，很快水解酵素。

可用蛋白脢的抑制劑防止之，但蛋白脢有數大類，各有不同類的抑制劑；一般使用 PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)是 Ser 型蛋白脢的抑制劑，但也抑制部分其它類型者；PMSF 在水溶液中很快就會降解。

(4) 酵素抑制劑： 在自然界中或以人工合成，發現許多酵素有抑制劑，可以專一性地抑制酵素活性；有可逆性的，也有不可逆的，通常不可逆抑制劑的效果都很強烈。

■ 各種蛋白脢 c. 如何保持活性 若酵素不太穩定，活性不易保持，請參考下列處理方式： (1) 儘快進行純化及各項分析，隨時保持在4℃或冰浴中。

(2) 讓酵素保存在硫酸銨固体沉澱中，要比溶液狀態安定得多。

(3) 勿讓高純度的酵素，保存在稀濃度溶液中，否則要加 BSA 當安定劑。

(4) 勿隨意凍結或解凍酵素液，可加防凍劑 (如甘油或醣類)以液態保存。

(5) 冷凍乾燥雖可長期保存酵素，但有些酵素活性可能會因而下降。

(6) 若容易受微生物污染，可經無菌過濾後保存 (當然也會損失一些酵素)。

　 TOP ▲ 　 2.3.4 酵素活性單位  　 　 活性單位 (activityunit)是酵素活性高低的指標。

一個活性單位的定義，是在固定溫及 pH下，每分鐘可催化 1 mmole 基質的活性。

但很多情況下，為了操作或計算的方便，直接用測定產物所得的吸光值，除以單位時間來表示活性，因此活性單位的定義可能不同。

有關酵素活性及其基本背景，請複習生物化學中的酵素章節；你在大學所念到的酵素知識，在研究所還是完全適用。

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